NEUROBIOQUIMICA DE LA ACTILCOLINA

NEUROBIOQUIMICA DE LAS NEURONAS COLINERGICAS

ASPECTOS HISTÓRICOS DE LA ACETILCOLINA

     Esta fue sintetizada en 1867 por Adolf von Baeyer, mucho tiempo antes de que se supiera que existían los neurotranmisores. Posteriormente, Henry Dale la aisló de  las plantas que contenían el alcaloide de la ergotamina en el año de 1914, y el mismo notó que la acetilcolina producía en los tejidos periféricos, el mismo efecto que la estimulación de los nervios parasimpáticos. Pero fue Otto Loewi,en 1921,  con su experimento de los corazones aislados de rana, uno inervado y el otro no, que demostró la transmisión humoral y el papel de la aceitlcolina en esto.

   Años después el propio Dale y sus colaboradores, identificaron en 1936, que el neurotransmisor de la placa neuromuscular era la acetilcolina.  Ambos hombres de ciencia Henry Dale y Otto Loewi, recibieron el premio Nobel de Medicina y Fisiologia por sus trabajos con la acetilcolina.  Fueron los posteriores trabajos de Langley aplicando nicotina en la placa muscular y muscarina en el musculo liso, que permitieron caracterizar las dos familias de receptores colinérgicos: nicotínicos y muscarínicos.

    La enzima de síntesis de la acetilcolina es la acetil colinesterasas (CAT), la cual se identifica en su sitio de síntesis, retículo endoplásmico rugoso en el pericarion neuronal o en las terminales axónicas de neuronas colinérgicas de hecho,  los anticuerpos que se obtienen de esta enzima, son buenos marcadores del fenotipo neuronal para decir si una célula es o no colinérgica.

La acetilcolina es un neurotransmisor que se ha involucrado en diferentes funciones como son la regulación motora, el ciclo de sueño y vigilia, memoria, sistemas de recompensa, entre las más representativas. AL mismo tiempo su papel en alteraciones neuropsiquiátricas es cada vez más relevante. Se destacan en estas a la enfermedad de Alzheimer, alteraciones de movimientos, depresión mayor y esquizofrenia. 

SINTESIS DE LA ACETILCOLINA

  La Ach es sintetizada a partir de dos precursores (fig 1): la colina y la acetil coenzima A  (AcCoa), mediante la enzima colina acetil transferasa (CAT). Esta última es una enzima que se encuentra soluble en el citoplasma y cataliza la transferencia de un grupo acetil de la AcCoA hacia la colina. Esta última es incorporada al interior del citosol mediante al menos dos mecanismos de trasporte activo. El primero es un mecanismo de difusión pasiva, común a otras células, como los eritrocitos y es independiente al sodio y cloro, se ha propuesto que este en muchas células neurales y no neurales y que interviene en la síntesis de fosfolípidos. . El segundo es un mecanismos de alta afinidad, el cual es sodio y cloro dependiente, localizado principalmente, aunque no de manera exclusiva, en las terminales colinérgicas, en donde bajo ciertas circunstancias se acopla con la síntesis de Ach. El análisis de la secuenciación de amino ácidos reporta trece dominios transmembranales, un sitio de glicosilaci´n extracelular, un sitio intracelular de fosforilación para las proteinas cinasas A y C.

    El buen funcionamiento de este sistema de captura acoplado a sodio y cloro es uno de los mecanismos de regulación de la actividad colinérgica. En ratones nockout para esta proteina, no sobrevivien a las pocas horas de nacidos, y mueren por parálisis de los músculos rspiratorios.

   La colina está presente en el plasma en concentraciones cercanas a 10 µM. También el mecanismo de alta afinidad  trabaja con estas concentraciones, por lo tanto los niveles de este sustrato en el plasma son adecuados para sostener la síntesis, inclusive en las condiciones de extrema demanda.

  La síntesis de Ach, en el pericarion parece estar acoplado a un mecanismo de difusión pasiva. La captura de la colina es a través del mecanismo de alta afinidad, la cual es estimulada por el aumento de la liberación de la Ach. Aproximadamente la mitad de la colina utilizada en la síntesis de Ach se origina de la recaptura del precursor colina, que se recicla después de la degradación de la Ach en la hendidura sináptica (fig 1 y 2). Otra fuente de colina la constituye la degradación de la fosfatidil colina, la cual parece aumentar como respuesta a la liberación de la Ach.

   La AcCoA es producida en la mitocondria por el complejo enzimático piruvato deshidrogenasa (PDH). Esta requiere del piruvato como sustrato, el cual normalmente es proporcionado por el proceso de glicólisis.  No se conoce el mecanismo mediante el cual la AcCoA es liberada de la mitocondria al citosol, sin embargo existen evidencias de que es un mecanismo que puede ser disparado por Ca++, y en el cual interviene el ácido cítrico.

La purificación de la CAT ha permitido la producción de anticuerpos específicos, y de esta manera se pueden hacer el mapeo de las regiones colinérgicas. Si una célula presenta tinción positiva a CAT podemos decir que es colinérgica, mientras que si resulta con tinción positiva para la acetil colinesterasa (AchE), la enzima responsable de la degradación de la Ach, entonces podremos decir que la neurona es colinoceptiva, ya que esta enzima se localiza en la membrana postsináptica, cerca de los receptores colinérgicos. Además de se deben de identificar alguno de los receptores colinérgicos (muscarínicos o nicotínicos).

   La CAT se encuentra en el sistema nervioso central específicamente en donde la síntesis de Ach se lleva a cabo. Grandes concentraciones de esta enzima están localizadas en el núcleo caudado, mientras que en el cerebelo hay poca concentración. La CAT está presente en altas concentraciones en las terminales nerviosas colinérgicas, aunque también se puede presentar en el axón. Se ha sugerido que la CAT pueda estar unida a la porción externa de la membrana y que de esta manera sea un mecanismo simultáneo al del almacenamiento. La enzima purificada es una proteína de 66 a 70 kilodaltons y la forma cerebral tiene una Kd para la colina de 1 mM mientras que para la AcCoA es de aproximadamente 10 µM (lo cual denota una mayor afinidad por el sustrato mitocondrial).

   Un transportador vesicular específico media la incorporación de la Ach recien sintetizada al interior de las vesículas presinápticas. Se le denomona Trasportador específico vesicular de Ach (VAchT = specific vesicular Ach transporter). Esta molécula transporta Ach al interior de la vesícula sináptica, en contra de gradientes de concentración, pues el interior de estas está simpre con ayor cantidad molecular de acetilcolina. La concentración de moléculas de acetilcolina en el interior de las vesículas, en pez torpedo puede llegar a ser de 1 Molar. Un agente farmacológico que bloquea este almacenamiento es el vesamicol. El efecto de esta droga sobre la transmisión colinérgica se ha evaluado en los potenciales en placa miniatura, que no se observan en preparaciones tratadas con vesamicol y la estimulación eléctrica de sus respectivas fibras neurales. VachT posee doce dominios transmembranales. Lo anterior es similar a otros sistemas de transporte vesiculaes de las monoaminas. El transportador de captura y el Vacht están codificados en el un intron del mismo gen, lo cual supone que ambos sistemas de transportadores esten corregulados. Las vesículas sinápticas en donde se almacena la acetilcolina contienen otras proteinas relevantes para la neurotransmisión. Estas son la sinaptobrevina, la sunaptofisina y sinaptotagminas. 

Después de la síntesis, la Ach  se encuentra  almacenada en las vesículas sinápticas. El papel que desempeña la Ach en las vesículas en el funcionamiento global del NT no es aún claro. Se ha propuesto que la Ach que se libera primero, como resultado del potencial de acción que llega a la terminal sináptica, es la que se localizada en el citoplasma, recién sintetizada. Mediante un mecanismo de compuertas, la Ach de las vesículas se intercambia con la que se localiza en el citosol y de esta manera juegan un papel secundario en la disponibilidad de Ach. Al mismo tiempo se han reportado dos tipos de mecanismos de liberación de Ach. Por un lado esta el mecanismo de liberación lenta, que se observa en las neuronas en reposo, el cual fue originalmente descrito por Fatt y Katz, este probablemente se presenta en todas las sinapsis colinérgicas. El segundo se presenta cuando un potencial de acción llega a la terminal presináptica. En el primer caso con la liberación lenta de la Ach, se producen los llamados potenciales miniatura o "Mini end plate potentials" (MEPP). (Potenciales miniatura en placa terminal). Se ha sugerido que cada potencial miniatura resulta de la liberación de cantidades finitas o "Cuantos" de Ach y cuando la terminal presináptica es despolarizada aumenta el número de "cuantos" de Ach liberados por unidad de tiempo. En una hipótesis alternativa se piensa que la Ach se libera directamente del citoplasma. En este modelo una cantidad definida de "cuantos" de Ach son liberados porque una cantidad definida de canales en la membrana están abiertos por un periodo de tiempo, que es cuando la concentración de Ca++ se eleva.

   Las vesículas de acetilcolina de mamíferos contienen aproximadamente 2,000 moléculas de Ach, ientras que las vesículas del pez torpedo tienen 20,000.

La liberación de Ach requiere de la presencia de Ca++ extracelular, el cual entra a las neuronas cuando éstas se encuentran despolarizadas. Se ha propuesto que una corriente de Ca++ que es voltage dependiente  sea el evento inicial para la liberación de la Ach., la cual ocurre 200 µsec más tarde. La presencia de toxina botulínica puede inhibir este proceso, esta es producida por la bactoria anaeróbica clostridium bltulinum, esta es mas portente a nivel periférico, lo cual lleva a parálisis de los músculos respiratorios y muerte por asfixia.

   Sin embargo la toxina botulínica tiene utilidades clínicas en manos expertas. Los cirujanos plásticos las usan para disminuir las arrugas faciales, contracciones dolorosas en músculos del cuello (tortícolis espasmódica), y problemas de sudoración excesiva.

 

EL RECEPTOR NICOTÍNICO.

    

    Fue este el primer receptor a neurotransmisores que se caracterizó bioquímicamente. Su localización en la placa neuromuscular hizo posible que se le explorara de manera extensiva con técnicas electrofisiológicas. Se utilizaron las especies de pez torpedo (es una matarraya) y el veneno de la vívora Bungarus multisinctus y en otras serpientes.

    El tejido electrico del pez tiene una alta densidad de receptores nicotínicos empaquetados y tienen el mismo origen embriológico que el de la unión neuromuscular, solo que con mayor densidad de receptores colinñergicos.  Este ótgano eléctirco, da descargas de menos de 60 volts y 150 amperes, <la concentración d elos recepotres de nicotina es de de 100 pmol/mg de proteina 1000 veces mayor que el de la placa neuromuscular. El veneno de la serpientes se llama alfa bungaro toxina, y fue uilizado para aumentar el peso de los recpetores y poder analizarlos y separarlos mediante la cromatografía, ademas que es una herramienta para detectar de manera selectiva a los receptores.

 

    El receptor nicotínico es una proteína pentamérica compuesta de unidades heterólogas, dos alfa, beta, gama y delta (receptor nicotínico de placa neuromuscular). Cada subunidad parece estar codificada por diferentes genes. Este receptor se aisló con la ayuda de algunas toxinas como la alfa-bungaro toxina y la toxina alfa de la Naja naja siamensis. Con la utilización de diferentes ligandos farmacológicos, se sabe en la actualidad que por lo menos existen varios subtipos de receptores nicotínicos. Los receptores nicotínicos en el cerebro están únicamente compuestos de unidades alfa y beta, y estas presentan diferencias entre si, de tal manera que hay subtipos de receptores nicotínicos dependiendo de las diferencias de las cadenas alfa (alfa-2, alfa-5, alfa-7) lo mismo ocurre con las cadenas beta. El mapeo y localización de las diferentes unidades de los receptores nicotínicos ha sido una tarea importante, ya que la localización de diferentes subunidades de los receptores nicotínicos pueden explicar una variedad de funciones de estos y la interacción con otros sistemas de neurotransmisión (por ejemplo, los subtipos alfa-7 se han involucrado en procesamientos de filtraje de tipo sensorial y se localizan en el tálamo).  La transmisión colinérgica es primariamente nicotínica en la médula espinal y sistema nervioso vegetativo, mientras que los receptores nicotínicos así como los muscarínicos, se localizan en áreas corticales y subcorticales. La relación entre receptores muscarínicos y nicotínicos en el SNC es a favor de los muscarínicos. Estudios estructurales de los receptores nicotínicos muestran que las subunidades se encuentran dispuestas alrededor de un canal central, con la más grande porción de la proteína expuesta hacia la superficie extracelular. La cavidad central es el ionóforo o canal iónico, el cual en el estado de reposo es impermeable a los iones. Cuando es activado, su diámetro se abre a 6.5 A. Este canal abierto es selectivo para cationes. Lla permeabilidad de este canal para algunos cationes  parece estar limitado en forma primaria al diámetro del canal abierto. La subunidad alfa, es el sitio  para la unión de los agonistas y antagonistas competitivos y es la superficie primaria a donde se asocia la toxina de víbora alfa-bungaro toxina. 

Un sitio para las uniones de ligandos existe en cada una de las subunidades alfa, la ocupación de ambos sitios es necesaria para la activación de los receptores. Existen indicaciones de que hay una cooperación positiva en la asociación con los agonistas.

Una gran variedad de respuestas se observadan en las células de vertebrados ante la señal de Ach. La activación de los receptores muscarínicos se ha relacionado a diversos efectos como aprendizaje, memoria, atención, estado de ánimo, nocicepción, termorregulación, función motora, sueño y funciones neuroendócrinas .

 

RECEPTORES MUSCARÍNICOS

     Los estudios de Langley y Dale demostraron que algunos efectos de la administración de Ach a nivel periférico, se podían mimetizar con la administración del alcaloide muscarina, que se obtiene el hongo Amanita muscaria, . Los efectos de la estimulación de los receptores muscarínicos se pueden distinguir de los nicotinicos claramente, los primeros son excitatorios o inhibitorios, mientras que los nicotínicos son siempre excitarios. Los receptores muscarínicos se bloquean selectivamente con atropina o escopolamina, mientras que los nicotínicos lo hacen con el curare.

    Además de estar presentes en nueornas y en glía, los receptores muscarínicos estan presentes en corazón, músculo liso, glandulas lacrimales y salivales.

   Existen evidencias bioquímicas, farmacológicas y genéticas que apoyan la existencia de al menos cinco tipos de receptores muscarínicos . La estructura de este receptor es semejante a la del receptor adrenérgico, ambos transducen las señales bioquímicas desde la membrana interactuando con las proteínas unidas a GTP (Proteínas G). La  participación de varias macromoléculas que interactúan con la activación del receptor muscarínico contribuyen a la observación de que la respuesta muscarínica es más lenta, comparada con aquélla mediada por los receptores nicotínicos. La estimulación de los receptores muscarínicos produce una de las siguientes tres respuestas: (1) inhibición de la adenilato ciclasa,  (2) estimulación de la fosfolipasa C y (3) activación de los canales de K+. A pesar de esta diversidad de respuestas en todos los casos hay una interacción con la proteína G. Dependiendo de la naturaleza de la proteina G, la interacción con el receptor inicia uno de los diferentes eventos bioquímicos que han sido mencionados previamente. El mecanismo mediante el cual los receptores muscarínicos inhiben a la adenilatociclasa es a través de la activación de una proteína G inhibitoria (Gi). Los agonistas muscarínicos estimulan la hidrolisis de fosfoinosítidos por activación de una fosfolipasa C que es específica para fosfoinosítidos (ver tabla 4). La activación de esta enzima también requiere del GTP. La hidrólisis de los bifosfatos de fosfatidilinositol conduce a dos potenciales de segundos mensajeros: el trifosfato de inositol (InsP3) y al diacilglicerol. Finalmente los agonistas muscarínicos también incrementan la conductancia específica a K+ y por lo tanto hiperpolarizan la membrana cardiaca y las membranas de otras células.  Este efecto muscarínico puede ser mimetizado por análogos de GTP y la respuesta es modificada por la toxina pertusi, la cual riboxila e inactiva a la proteína Gi. La propuesta de que la proteína G se une al receptor muscarinico en el canal a K+ es apoyada por datos recientes, que muestran que las subunidades purificadas de la proteína G regulan la conductancia a K+ y también por la evidencia de que otros receptores acoplados a canales lo hacen a través de un mecanismo similar.

    Los receptores musscarínicos se han involucrado en varias funciones del sistema nervioso: cognición, aspectos sensoriales, motores, procesos de reforzamientos. Los antagonistas del subtipo M1, se han involucrado en problemas cognitivos. En la enfermedad de Parkinson, la reducción severa de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra es el hallazgo patológico central. Esto hace que se pierda el balance entre estructuras dopaminérgicas y colinérgicas, que intervienen en la regulación motora. Por esta razón se empelan agentes anticolinérgicos de manera conjunta con agentes que aumenten la síntesis de dopamina (Vg. L-Dopa). Agentes como el trihexifenidil o biperideno, se emlean para dichos fines. Lo mismo se hacía, cuando se empleaban los llamados antipsicóticos típicos, que como efecto secundario al bloquear los receptores doppaminérgicos D-2, inducían el parkinsonismo, el cual era aliviado con estos anticolinérgicos.

   El estudio con animales transgénicos, a cada uno de los subtipos de receptores muscarínicos, ha permitido entender mas de las funciones en las que puedan estar involucrados.  Los animales con este tipo de manipulación selectiva son viables y fértiles. EL ratón transgénico para el receptor muscarínico M1 mostró dificultades en las pruebas que implican memroia de trabajo y consolidación de la misma. Lo anterior  comprobaba el papel de estos receptores en meoria y aprendizaje. Además que estos animales fueron resistentes a la inducción de epilepsia con pilocarpina, como ocurre en los animales intactos. Esto pone de relieve el papel de este subtipo de receptor en la epilepsia.

 En animales transgénicos para el stipo M2, se observó deficiencias en la prueva de de evitación pasiva, memoria de trabajo, y en potenciación a largo plazo en el hipocampo. Tambien tienen una reducción de la analegesia inducida por agosnistas M2. También interviene en la regulación de la temperatura, ya que los agonistas muscarínicos porucen hipotermia. Muchos efectos observados en los animales transgénicos a M2, se sinergizaron en animales knockout a M4 y M2.  Respecto a los subtipo M3 y M5, que tienen poca densidad en el SNC; se observó que los ratones transgénicos tenían problemas de hipofagia, y problemas en la regulación del apetito.